[Zurück]

D. Bovenkamp:
"Single molecule studies of initial T-cell activation";
Betreuer/in(nen): G. Schütz, M. Brameshuber; Institut für Angewandte Physik (E134), 2016; Abschlussprüfung: 31.10.2016.

CD 4+ T Lymphozyten sind in der Lage, geringste Mengen an pathogenen
Peptiden, die von speziellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) präsentiert
werden, zu erkennen. Nach der erfolgreichen Erkennung des krankhaften
Peptids folgt die Initialisierung der T Zell Aktivierung, welche mit
großen strukturellen Veränderungen und Calzium Ausschüttung einhergeht.
Den wichtigsten Proteinkomplex stellt der T Zell Rezeptor (TCR) dar, da
er für die Unterscheidung zwischen ungefährlichen und krankhaften Peptiden
verantwortlich ist. Der T Zell Rezeptor bindet an das Peptid, das
im peptide major histocompatibility complex (pMHC) an der Oberfläche der
APC präsentiert wird. Diese Interaktion zwischen TCR und pMHC ist aktueller
Gegenstand kontroversieller Diskussionen in der Immunologie. Das
Ziel dieser Diplomarbeit war ein tieferes Verständnis der Interaktion zwischen
TCR und pMHC auf Einzelmolekülniveau zu erlangen. Dabei wurden
Erkenntnisse über die Interaktion von einzelnen pMHC mit TCR mittels
single molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) Ereignissen, Immobilisierungen
und Diffusionskonstanten von verschiedenen Peptiden im
pMHC Komplex unter aktivierenden und nicht-aktivierenden Bedingungen
gewonnen. Die Korrelation zwischen smFRET und Immobilisierungen
konnte zeigen, dass die direkte Interaktion von pMHC und TCR kürzer ist,
als die dazugehörige Immobilisierung. Darüberhinaus wurden Diffusionskonstanten
von verschiedenen Peptiden im pMHC Komplex und einem
fluoreszenzmarkierten Cholesterol als Negativkontrolle unter und neben
der T Zelle gemessen und verglichen. Hierbei wurde demonstriert, dass
die Moleküle unterhalb der T Zelle nicht nur langsamer diffundieren, sondern
auch immobilisiert werden - im Gegensatz zu Molekülen neben der T
Zelle. Mit dieser Arbeit konnten weitere Einblicke in die Interaktion von T
Zell Rezeptor mit pMHC gewonnen werden.

CD4+ T lymphocytes are capable of detecting low amounts of pathogenic
peptides presented by antigen presenting cells (APC). The initial T cell activation
upon successful recognition goes along with large structural changes
and internal Calcium signaling. The crucial protein complex in the discrimination
between different self and pathogenic peptides is the T cell receptor
(TCR). It binds to its counterpart on the antigen presenting cell (APC), the
peptide carrying major histocompatibility complex (pMHC). Binding dynamics
between TCR and pMHC are highly debated in the immunological
community. The main goal of this master thesis was to probe the interaction
of the TCR with the pMHC on a single molecule level, with the latter
being embedded in a synthetic lipid bilayer membrane. To this end,
dwell times of single molecule Förster resonance energy transfer (smFRET)
events, times of immobilizations and diffusion constants of various pMHCs
under activating and non-activating conditions were determined. By comparing
smFRET with immobilisation data, it was possible to show, that the
direct TCR-pMHC interaction lasts shorter than the corresponding immobilization
time. Furthermore, diffusion constants of various pMHC variants
and a fluorescently labeled cholesterol-analogue under and adjacent to the
T cell synapse were compared with each other. Thereby, it was feasible to
demonstrate, that molecules in the interface of the T cell and the synthetic
antigen presenting cell (APC) not only immobilized but in addition exhibited
a reduced diffusion constant. Diffusion constants of pMHCs under
activating and non-activating conditions - realized by a high versus a very
low density of pMHC molecules - were compared, which also revealed differences
in the diffusion performance. Taken together, presented studies
allowed for a deeper insight in the interaction of the TCR with the pMHC.